Живописец, театральный художник, коллекционер. Друг П.М. Третьякова. Его учителями были такие художники, как А. А. Киселёв, И. Е. Репин и П. П. Чистяков.
Участник Мамонтовского художественного кружка (с 1880). Член Товарищества передвижных художественных выставок , Союза русских художников. Действительный член Академии художеств.
В Абрамцеве писал пейзажи, участвовал в любительских спектаклях.
Основная тема в произведениях Ильи Семеновича — проникновенные русские пейзажи. Природу средней полосы России художник писал много и увлеченно, в разное время года, при разном освещении. Об этом говорят его работы — «Золотая осень», «Первая зелень», «Сиверко», «В Абрамцевском парке».
В пейзажах Остроухов умел мастерски выразить эмоциональные образы русской природы. Подобно Левитану, создавал «пейзажи настроения».
Нужно отметить, что значительная часть шедевров древнерусской иконописи, собранная Остроуховым, легла в основу Государственной Третьяковской галереи.